На страницах нашего сайта Вы можете ознакомиться с научным докладом:"Действие БАД «Шиитаке –Фунго-ШИ»
На страницах нашего сайта Вы можете ознакомиться с научным докладом:"Действие БАД «Шиитаке –Фунго-ШИ» на основе грибов Lentinus edodes (Шиитаке)(производитель ООО «Шиитаке») на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха." Научный доклад. Действие БАД «Шиитаке Фунго-ШИ» на основе грибов Lentinus edodes (Шиитаке), (производитель ООО «Шиитаке») на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха. <Филиппова И.А., Разин А.Н. ООО «ШИИТАКЕ». Дерягина В.П.. Рыжова Н.И. Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, РАМН. Волков М.Ю. Управление начальника войск радиационной, химической и биологической защиты. Продолжающийся рост заболеваемости злокачественными новообразованиями в России ставит все более актуальной задачу ее профилактики. Наряду с другими направлениями, она включает исследования на антиканцерогенную активность отдельных природных соединений, химических препаратов или продуктов с целью включения в рацион человека для предупреждения или снижения возможности развития у него заболевания. К настоящему времени накопились сведения о том, что многие соединения, входящие в состав грибов обладают иммуномодулирующим действием, активирующим звено неспецифической противоопухолевой защиты, и повышают продукцию интерферона в крови.Японский гриб Lentinus edodes(Шиитаке) характеризуется сложным составом, включающим полисахариды, простые сахара, аминокислоты, липиды, алкалоиды, фенолы, витамины группы В, С, эргостеролы, минеральные вещества и др. соединения. Его биорегулирующие эффекты связывают, прежде всего, с полисахаридом лентинаном, проявляющим модифицирующее действия на активность клеток врожденного иммунитета. Высказывается мнение, что лентинан также как и классические иммуномодуяторы - тимозин, Т-активин, левамизол обладают биорегулирующим разнонаправленным эффектом, способным усиливать слабую, ослаблять сильную или оставлять без изменения нормальную реакцию иммунной системы [6,11]. Показано, что лентинан, входящий в состав грибов Ganoderma L, вызывал у больных меланомой, усиление Т-киллерной активности и нормализовал другие показатели клеточного иммунитета [6]. В системе противоопухолевой защиты важная роль принадлежит неспецифической противоопухолевой резистентности, составляющими элементами которой являются макрофаги, нейтрофилы и NK (natural killer) клетки. Макрофаги и нейтрофилы распознают и эффективно элиминируют трансформированные и опухолевые клетки независимо от того, экспрессируют ли последние специфические опухолевые антигены. Помимо этого макрофаги и нейтрофилы играют инструктивную и контролирующие роли в индукции специфического (адаптивного) иммунитета [4.5]. 1 активации NADPH-зависимой оксидазы, что приводит к образованию ряда высокоактивных форм кислорода (супероксид анион-радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород). Все эти соединения обладают мощным окислительным и антимикробным потенциалом и в значительной мере определяют цитостатическое и цитотоксическое действие макрофагов и нейтрофилов, в том числе, и по отношению к опухолевым клеткам [1.8]. Задачей настоящего исследования является экспериментальное изучение противоопухолевых свойств грибов Lentinus edodes (БАД «Шиитаке» торговой марки Фунго-Ши) на модели перевивной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) и возможного модулирования под влиянием грибов важных элементов противоопухолевой защиты: функциональной активности нейтрофилов крови, макрофагов перитонеального содержимого и активности NO -синтазы. Методика исследования. Работа проведена на 52 мышах С57В1, разводки питомника «Столбовая» РАМН. Миши были разделены на 5 групп: интактная группа (здоровые мыши), n=5, мыши, получавшие водную суспензию грибов Lentinus edodes -Шиитаке (188 мг/кг), п=5. Контролем служили мыши с подкожно перевитой аденокарциномой Эрлиха (106 клеток в 0,5 мл Хенкса), n=13. Остальные две опытные группы по 14 и 15 мышей в каждой, составляли мыши с перевитой АКЭ, получавшие 5 раз в неделю в течение месяца до перевивки и после перевивки АКЭ суспензию грибов, в разовой дозе 188 или 376 мг/кг. Ингибирующее рост опухоли действие грибов оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) у животных опытных групп в сравнении с контрольной группой: ТРО = (Vк-Voп)/Vк х 100 %; где VK - средний объем опухоли в контрольной группе, Von -средний объем опухоли в опытной группе (мм3). Выделение активных форм кислорода фагоцитами крови и перитонеальной жидкости (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) определяли по люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) [2,3,10],регистрируемой прибором Биолюмат, модель 9500 («Berthoold, Германия). Резидентные клетки перитонеальной жидкости получали промыванием брюшной полости раствором Хенкса в объеме 2 мл. Перитонеальные клетки осаждались на предметном стекле в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин. После фиксации в метаноле и окрашивания их по Романовскому-Гимза определяли клеточный состав перитонеальной жидкости по морфологическим критериям. Для постановки реакции определения спонтанной (СХЛ) и фагоцитозависимой хемилюминесценции (ФЗХ) крови и клеток перитонеального содержимого смешивали 0,2 мл Хенкса + 0,1 мл люминола (0,56 мМ) + 0,1 мл крови (предварительно разведенной в 4 раза р-ром Хенкса) или 0,1 мл перитонеальной жидкости. В качестве активатора фагоцитоза использовали грибы Candida albicane, опсонизированные сывороткой 10-12 здоровых доноров. ХЛ измеряли в течение 30 мин, с интервалом в 5 мин. Известно, что хемилюминесцентный ответ крови и перитонеальной жидкости определяется, в основном, фагоцитирующими клетками: нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, способными продуцировать активные формы кислорода, в том числе супероксид-анион радикал, гидроксил-ион, синглетный кислород и др. Учитывая это, а также исходя из клеточного состава изучаемого объекта, можно принять, что в крови уровень АФК определяется, в основном, нейтрофилами. Моноциты, присутствующие в крови в меньшем количестве и проявляющие более низкую хемилюминесцентную активность (до 10 раз), вносят меньший вклад в общий хемилюминесцентный отклик крови [12,13]. ХЛ активность макрофагов перитонеального содержимого рассчитывали по формуле, учитывающей количество макрофагов и нейгрофилов и соотношение их активности (соответственно 1:10). а = XJI/lm + 10п; где: а - активность макрофагов; m - количество макрофагов; n - количество нейтрофилов. Содержание нитритов (НИ) в биологических жидкостях: крови, перитонеальном содержимом и моче определяли методом Грисса [3]. Нитраты (НА), при их определении, предварительно восстанавливали до НИ пористым кадмием и анализирован и тем же методом. Для сбора мочи мышей помещали по 6 шт. в обменные клетки на сутки, лишив корма при свободном доступе к дистиллированной воде. Во избежания разрушения НИ в емкости для сбора мочи вносили 0,3 мл 30 % гидроксида натрия. При анализе НА и НИ в опухолевой ткани, опухоль измельчали на мелкие кусочки, тщательно растирали в фарфоровой ступке. Опухолевую ткань ( навеска 5г) экстрагировали в дистиллированной воде (40 мл) на водяной бане при температуре 90° С в течение 15 мин. Затем экстракт охлаждали до комнатной температуры и доводили дистиллированной водой до 50 мл. Для удаления белково-углеводной составляющей в экстракте опухолевой ткани, перитонеальном содержимом и моче использовали водные растворы калия железистосинеродистого и цинка сернокислого [3]. Статистическую обработку данных, представленных как среднее арифметическое значение +_стандартное отклонение, проводили используя критерий Стьюдента [9]. Результаты и обсуждение. Результаты действия водной суспензии Бад «Шиитаке - Фунго-ШИ» на рост АКЭ в течение 33 дней наблюдения после индукции опухоли следующие: клетки АКЭ были чувствительны к максимальной дозе (376 мг/кг) при пероральном введении суспензии грибов мышам. При этой дозе, уже на ранних сроках наблюдения отмечается незначительная задержка роста опухоли (12,4-13,1% но объему), наиболее выраженное достоверное ТРО регистрируется к 12 суткам и составляет 51%. В этот период у некоторых мышей этой группы отмечали замедление формирования опухолевого узла. При введении мышам меньшей дозы (188 мг/кг), эффект действия грибов был менее выражен, достоверное снижение роста опухоли составило 41,6% и проявлялось на тех же сроках, что и в первом случае. В дальнейшем, среднее арифметическое значение объема опухоли у мышей, потреблявших суспензию БАД, было на 20-30% меньше, чем у контрольных животных, и такое различие регистрировали до конца наблюдения. Случаи гибели мышей с АКЭ. потреблявшие грибы, имели место на более поздних сроках (после 28 суток), чем в контроле. Результаты взвешивания опухолей, выделенных после декапитации мышей, на 37 сутки после индукции АКЭ показывают, что среднеарифметическое значение массы опухоли у мышей, которым вводили грибы хотя и не значимо, но было меньшим на 20,2 и 22,9% соответственно, в прямой зависимости от дозы. Анализ данных лейкоцитарного состава клеток крови у мышей в конце эксперимента показывает, что мыши с АКЭ характеризуются более высоким уровнем количества лейкоцитов по сравнению мышами интактной группы, причем у мышей, потреблявших грибы, отмечается рост этого показателя. Наряду с этим в крови животных с опухолью наблюдается увеличение относительного количества нейтрофилов, а введение грибов несколько усиливает эту тенденцию. Данные определения функциональной активности нейтрофилов в крови но выделению активных форм кислорода в хемилюминесцентном тесте показывают снижение активности нейтрофилов в спонтанном состоянии у мышей с АКЭ. Показатель ФЗХ крови мышей с АКЭ, при стимулировании фагоцитарного процесса Candida albicane, был близким к значениям интактной группы. Значение коэффициента стимуляции фагоцитоза, рассчитанного по соотношению величины ФЗХ к СХЛ, было максимальным у здоровых мышей, которым вводили грибы в дозе 188 мг/кг. Такое стимулирующее действие грибов не сохранялось у мышей с опухолью. Определение клеточного состава перитонеального содержимого мышей показывает, что введение здоровым мышам грибов (188 мг/кг) приводит к достоверному в 4,9 раза повышению общего количества клеток. Увеличение количества клеток в перитонеальной жидкости здоровых мышей при введении грибов (188 мг/кг) происходил, в основном, за счет возрастания доли и абсолютного количества лимфоцитов. Увеличение общего количества клеток в 4,7 раза в сравнении с животными интактной группы присуще и для мышей с АКЭ, не потреблявших грибы. В то же время, у мышей с АКЭ, которым регулярно вводили суспензию БАД «Шиитаке – Фунго-ШИ», наблюдали нормализацию этого иммунологического показателя сравнимого с уровнем здоровых мышей. У животных с АКЭ видовой состав клеток в перитонеальном содержимом (соотношение макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, лимфоцитов) отличается существенным возрастанием относительного количества нейтрофилов в 6,1-6,9 раза и одновременным снижением доли макрофагов в 2,2-2,4 раза. Введение грибов практически не сказывалось на видовом соотношении клеток у мышей с опухолью. Измерение ХЛ макрофагов перитонеального содержимого у мышей с АКЭ, потреблявших грибы, выявило высокозначимое повышение активности этих клеток, как в спонтанном состоянии, так и при их активации Candida albicane. Особенно, это наглядно проявляется у мышей, получавших грибы в дозе 188 мг/кг, активность макрофагов у которых в спонтанном состоянии возросла в 36,8, а при их активации в 58,2 раза в сравнении с таким же показателем для мышей с АКЭ. Более высокая доза вводимых грибов - 376 мг/кг также вызывала хотя и значимую активацию макрофагов, но существенно в меньшей степени. Наряду с этим, еще один показатель - коэффициент усиления активности макрофагов при их инкубации с Candida albicane, по сравнению с показателем СХЛ, отражающий скрытый потенциал клеток, указывает на рост функциональной активности макрофагов перитонеального содержимого мышей, получавших грибы. Результаты определения нитритов (НИ) и нитратов (НА) в опухолевой ткани, перитонеальном содержимом, моче, приведенные в табл. 7 отражают интенсивность их эндогенного образования в организме. Источником эндогенного образования НИ и НА является оксид азота, продукт активности NO-синтаз (конститутивной и индуцибельной). Оксид азота, окисляясь, образует более стабильные соединения — НИ и НА. Принято считать, что способность к активации индуцибельной NO-синтазы (NO-c) в макрофагах, моноцитах, нейтрофилах является одной из важных характеристик неспецифической противоопухолевой резистентности этих клеток. Имеются данные о том, что рост и стадия опухоли связаны с изменением содержания NO-c в опухолевой ткани. Определение НИ и НА в опухолевой ткани выявило достоверное в 2,2 раза снижение образования НА в опухолевой массе мышей, получавших БАД «Шиитаке –Фунго-Ши» в дозе 188 мг/кг в сравнении с мышами с АКЭ. В то же время, опухоли мышей, получавших максимальную дозу грибов (376мг/кг) содержали НИ и НА на уровне мышей контрольной группы. Анализ НИ в перитонеальной жидкости мышей показал более высокий их уровень у интактных мышей. Животные с опухолями имели (на 29,4-64,7%) более низкое содержание НИ в перитонеальной жидкости. Наиболее интенсивное выведение НИ и НА с мочой, отражающее суммарное количество эндогенного образования их в течение суток, зафиксировано у мышей с АКЭ и у мышей, получавших максимальную дозу грибов. Образование этих соединений превышает в 8,4 раза и в 8.9 раза уровень интактных животных. Таким образом, результаты экспериментального исследования показывают: БАД «Шиитаке - Фунго-ШИ» вызывают умеренное торможение роста АКЭ, и этот эффект более отчетливо проявляется при введении максимальной дозы вещества (376 мг/кг). Рост опухоли сопровождается увеличением количества лейкоцитов в крови с одновременным увеличением относительного количества нейтрофилов. У животных с опухолями усилены свободнорадикальные процессы: стимулировано образование нитросоединений: НИ и НА в организме, по-видимому, в основном, за счет их образования в опухолевой ткани. Введение грибов здоровым животным приводило к увеличению общего количества клеток в перитональном содержимом, прежде всего за счет лимфоцитов и макрофагов. Поступление грибов в организм мышей до индукции АКЭ и в течение роста опухоли, нормализовало количественный показатель содержания клеток в перитонеальной жидкости и одновременно вызвало выраженную активацию макрофагов перитонеального содержимого. Выявлено снижение содержания НИ в перитонеальной жидкости мышей с опухолями, что может являться следствием подавления продукции оксида азота и их метаболитов макрофагами и нейтрофилами под влиянием продуцирующих опухолью активных соединений. Ранее было показано, что оксид азота, секретируемый макрофагами и нейтрофилами, выполняет защитную роль, направленную на инактивацию чужеродных клеток, в том числе и опухолевых. Введение биодобавки в максимальной дозе корригировало активность макрофагов по показателю образования оксида азота до уровня активности клеток у здоровых мышей. Что касается образования НИ и НА в опухолевой ткани, то БАД либо не влияли, либо существенно снижали содержание продуктов окисления оксида азота в опухоли. Роль оксида азота в опухолевом росте неоднозначна и пока выяснена недостаточно. Имеются данные о наличии связи между содержанием/активностью NO-c и прогрессией опухолевого роста. Можно выделить опухоли желудочно-кишечного тракта и молочной железы, в которых в ряде исследований, зарегистрировано уменьшение содержания/активности NO-c по мере прогрессии опухоли. В новообразованиях других локализаций наблюдается прямая корреляция между стадией опухоли и содержанием NO-c [7,14]. Секретируемый радикал может выступать в роли медиатора и промотора роста опухоли. Продолжительное образование повышенных количеств оксида азота может запускать ряд процессов, благоприятствующих росту и инвазированию опухоли: снижать активность гена р53. стимулировать рост новых сосудов, подавлять межклеточное сцепление клеток в опухоли, улучшать питание опухоли за счет релаксации сосудов и др. Выводы. Суммируя полученные результаты можно заключить: регулярное пероральное введение водной суспензии грибов Lentinus edodes (порошок Шиитаке, Фунго-Ши) вызывает умеренное торможение роста АКЭ у мышей С57В1 и этот эффект более отчетливо проявляется при максимальной дозе —376 мг/кг. Можно предположить, что способность грибов модулировать количественный и качественный состав перитонеальных клеток, активируя макрофаги - клетки неспецифической противоопухолевой резистентности, имеет прямое отношение к механизму, объясняющему ингибирование опухолевого роста.
